细胞计数2-改良牛鲍氏血细胞计数板的使用
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血细胞计数板的规格较多，在我国多采用改良牛鲍氏血细胞计数板，用于目视法细胞计数。其构造如图所示（图1、2 ）。该器材是由长方形无色厚玻璃制成，正面观察，可见中央刻有两个计数室平台，由“H”型沟槽相隔。与计数板长轴垂直的沟槽外侧各有一条与之平行的凸出的支持柱，用以承载血盖片，支持柱的外侧仍为与长轴垂直的沟槽。沿计数板长边侧面观察，可见支持柱略高于计数室平台（落差0.1mm），如将血盖片搭载于支柱上，盖片与计数室平台之间即形成0.1mm的缝隙。此时将液体充入盖片与计数室之间，则液层的厚度（或深度）也为0.1mm。
在显微镜下，可见每个计数室平台上均刻有清晰的网格划线。由网格线围成的正方形区域为细胞计数区，最大正方形边长3mm，分为9个大方格，每个大方格边长1mm，面积1mm2，若覆以盖片并充满液体，液体的体积为0.1mm3（0.1μl），四角的四个大方格分别以单划线分为16个方格，用作计数白细胞。位于中央的大方格，以双线分成25个中方格，每个中方格又以单线划分为16个小方格，则中央大方格共分为400个小方格。用作计数红细胞及血小板。划分中央大方格的划线向其四周延伸，则除四角大方格之外的四个大方格均为条形格所分隔（图3）。各计数区的计数对象、范围和换算方法见表（表2-1）。
覆盖计数室的盖玻片为专用的血盖片，长25 mm，宽20mm，厚0.6mm，透明、均匀一致。使用时，用水稍微沾湿计数室两侧的支持柱，以推压法将盖片平放在计数室表面，尽量减少盖片与支柱之间的空气。用吸管吸取制备后的细胞悬液，沿盖片与计数室之间的缝隙充入计数室。在光线稍暗的视野中高倍镜下计数中央大方格的四角及中间5个中方格的红细胞数。
由于划线部分也占有计数室的总面积，因此对压线细胞也应列入计数，为避免重复计数或漏计，一般遵循数上不数下，数左不数右的原则（（图4））。
改良Neubauer血细胞计数板的构造
1．俯视图 2.长轴剖面图 3计数室划线 4细胞计数原则
表2-1 血细胞计数室各计数区的计数对象、范围和单位换算
计数区域 计数细胞种类 计数面积及体积 换算方法（以细胞个数/L计）
四角四个大方格 白细胞 4mm2,0.4mm3 N/4×10×稀释倍数×106
四角及中央5个中方格 红细胞、血小板 0.2mm2，0.02mm3 N×5×10×稀释倍数×106
两侧计数室四角及中央5个大方格，共10个大方格 嗜酸粒细胞、脑脊液、浆膜腔穿刺液细胞、精子 10mm，1.0mm3 N×稀释倍数×106
【质量控制】
血细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中由于操作人员采血不顺利，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（filed error）。仪器误差和分布误差统称为固有误差或系统误差。技术误差和仪器误差可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正，但细胞分布误差却难于彻底消除。因此，搞好红细胞计数的质量控制一般需采用以下措施。
1．避免技术误差，纠正仪器误差
（1）所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。①计数板的鉴定：要求计数室的台面光滑、透明，划线清晰，计数室划线面积准确。必要时采用严格校正的目镜测微计测量计数室的边长与底面积，用微米千分尺测量计数室的深度。美国国家标准局（NBS）规定每个大方格边长的误差应小于1%，即1±0.01mm，深度误差应小于2%，即0.1±0.002mm。若超过上述标准，应弃之不用。②血盖片应具有一定的重量，平整、光滑、无裂痕，厚薄均匀一致，可使用卡尺多点测量（至少在9个点），不均匀度在0.002mm之内。必要时采用平面平行仪进行测量与评价，要求呈现密集平行的直线干涉条纹。最简单的评价方法是将洁净的盖片紧贴于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的时间不脱落，落下时呈弧线形旋转，表示盖片平整、厚薄均匀。同时，合格的盖片放置在计数室表面后，与支持柱紧密接触的部位可见到彩虹。精选出的盖片与其他盖片紧密重合后，在掠射光线下观察，如见到完整平行的彩虹条纹表示另一枚盖片质量也符合要求。③目前临床实验室多采用一次性微量采血管采集毛细血管血，除注意定点购买使用信誉较好厂家的产品外，还应对每一批量的采血管进行抽样检查，可通过水银称重法或有色溶液比色法进行校正，误差不应超过±1%。
（2）红细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质微粒。
（3）严格操作，从消毒、采血、稀释、充池到计数都应规范，尤其应注意的是血样稀释及充池时既要作到充分混匀，又要防止剧烈震荡为破坏红细胞。必须一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与血盖片之间的矩形边缘为宜。
（4）报告法定计量单位。
2．缩小计数域误差或分布误差 由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或称Poisson分布（ ），而我们所能计数的细胞分布范围是有限的，由此造成的计数误差称为计数域误差或分布误差。缩小这种误差的有效方法就是尽量扩大细胞计数范围和计数数目，一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范围，只要能将误差控制在允许范围内即可。Berkson指出，当使用同一支吸管、同一面计数室，计数0.2mm2面积的细胞数，有望将 CV控制在可接受的7%以内。对于红细胞计数而言，由于红细胞数量较多，在计数室中显得比较“拥挤”，根据Poisson公式（ ）推断， 。欲将误差控制在变异百分数5%以内，至少需要在计数室中计数400个红细胞，因此要求计数五个中方格的红细胞。事实上Berkson还通过实验证明，红细胞的计数域误差为s=0.92 ，较理论误差（Poisson分布误差）要小。
3．排除异常标本的干扰 白细胞数量在正常范围时，相对于红细胞数量来讲，其影响可忽略，但如白细胞过高（>100×109/L），则应对计数结果进行校正。方法是：①实际RBC=计得RBC-WBC。如当红细胞换算后为3.5×1012/L、白细胞换算后为100×109/L时，病人实际红细胞数应为3.4×1012/L。②在高倍镜下计数时，避开有核细胞。有核细胞体积比正常红细胞大，中央无凹陷，无草黄色折光，可隐约见到细胞核。此外，当病人急性严重贫血时网织红细胞可提前大量释放，也给红细胞计数带来一定的干扰，而且影响网织红细胞绝对值计算结果。其校正方法有待探讨。
4．积极搞好室内及室间质量评价（IQC和EQA）一般用两差比值法或双样试验标准差评价法进行质量评价或工作人员自我考核；变异百分数法通常用于评价白细胞计数的结果。
（1）两差比值法 用于考核实验结果的精密度。采用同一稀释血样间隔2h后进行重复计数，求出两次镜下计数值之差（取绝对值）与两次计数值标准差的比值，即两差比值（r）。
评分：score==100-20.1r，20.1为失分系数（40/1.99）。评级：90-100 为优秀，80-89为良好，70-79为中等，60-69为及格，<60时为不及格。
X1和X2分别为前后两次镜下计数值，而非换算后的细胞浓度，r<2为合格，r≥2说明两次计数值的差异具有显著意义。也可以用这种方法评价治疗效果是否显著，方法是采用该公式计算同一患者治疗前和治疗一段时间后两次镜下计数值的差异。
（2）双样试验标准差评价法 WHO要求同一实验室每天至少完成10例标本的双样测定（duplicate test），求出双样测定的标准差[S(dup)]，以评价实验结果的精密度，双样测定结果之差（d）≤2S(dup)为合格。
n为测定例数，∑d2为双样之差的平方和。
【参考值】见血红蛋白测定
【临床意义】见血红蛋白测定